Logo depois de chegar a São Vicente e instalar a organização administrativa que transformava o povoado em Vila, Martim Afonso de Sousa mandou demarcar terras e as distribuiu em lotes aos colonos. A posse era provisória, em alguns casos, e o donatário poderia utilizá-la apenas enquanto a cultivasse. O uso correto e a produção constante resultavam no título definitivo de propriedade.

Começou-se, então, o cultivo organizado de vários produtos, com destaque para o trigo, a vinha e a cana-de-açúcar. Para estimular o setor açucareiro, Martim Afonso de Sousa mandou erguer um pequeno engenho movido à água no centro da Vila, o primeiro engenho do Brasil. Com o sucesso desse primeiro, outros engenhos foram construídos em toda a região e, em poucos anos, São Vicente já vendia açúcar e aguardente para outras Capitanias brasileiras e até exportava os produtos para o Reino.

Com o sucesso alcançado, o passo seguinte foi a organização de uma empresa mercantil para a comercialização do excedente, já que a produção era bem superior às necessidades do consumo local. Martim Afonso de Sousa, mais uma vez, foi o pioneiro em terras brasileiras. Foi dele a iniciativa de criar uma instituição que representasse diretamente os colonos nas negociações de venda local e exportação dos produtos locais, além da intermediação da aquisição de gêneros europeus. 

O progresso da Vila era tal que muitos colonos portugueses pensaram em mandar vir as famílias que haviam deixado para trás. Foram tempos de glória, pois todo o movimento econômico da Ilha e redondezas era concentrado aqui. São Vicente abrigou o primeiro empório marítimo da costa, que se localizava onde hoje está o Porto das Naus. Também foi daqui que saíram as primeiras expedições portuguesas para o Interior, inclusive a que fundou a Vila de São Paulo de Piratininga.

A agricultura prosperava nessa fase. Os índios cultivavam a mandioca, o milho, o arroz, o algodão e várias espécies de batatas. Além disso, eles industrializavam a farinha de mandioca e produziam variado artesanato. O algodão nativo passou a ser cultivado, dando origem à indústria caseira de tecido. Nesse pormenor, as técnicas dos brancos prevaleceram sobre as nativas, embora os índios e os mestiços fossem os tecelões mais hábeis da Capitania. 

A criação de gado, cavalos, ovelhas, cabritos e galinhas também tiveram início nessa época. Trazido da Europa pelo mar até o Porto de São Vicente, o gado era levado para a Bahia e outras Capitanias do Nordeste. Na direção do Oeste, chegaram aos currais de Goiás e Mato Grosso. Em Minas Gerais, eram famosas as manadas de gado dos criadores de São Vicente. A nova atividade econômica gerou emprego aos índios que aqui viviam.